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侖昌碩生物??????小鼠環(huán)*酸腺苷（cAMP）elisa試劑盒

? ? ? ?[背景]熱應(yīng)激(HS)可導(dǎo)致機體重要臟器損傷甚至引起死亡,全身性炎癥反應(yīng)是其主要原因之一.NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)炎癥小體在介導(dǎo)組織損傷引起的無菌性炎癥中起重要作用,但其在HS損傷中的作用及機制尚不清楚.[目的]探討NLRP3炎癥小體在HS小鼠系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)和多器官損傷中的作用.[方法]設(shè)立野生型C57BL/6雄性小鼠對照組,HS組,以及NLRP3敲除HS組(Nlrp3-/-HS組),每組8只.利用溫度(41.0±0.5)℃,濕度(65±5)的高溫環(huán)境模擬艙對HS組和Nlrp3-/-HS組小鼠進(jìn)行HS.每隔15～20 min監(jiān)測肛溫以及記錄一般精神身體狀況.當(dāng)HS組小鼠肛溫均超過42.0℃,立即將兩組小鼠移至正常室溫環(huán)境,于室溫恢復(fù)4h,解剖三組小鼠.HE染色觀察小鼠肝 腦和腸組織的病理改變;采用ELISA試劑盒檢測各組的血清腫瘤壞死因子α (TNF-α),白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-6的水平;采用內(nèi)毒素檢測試劑盒檢測血清內(nèi)毒素水平;采用免疫印記法檢測腸閉鎖蛋白(Occludin),閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)的表達(dá)水平,以及腦,和腸道組織NLRP3,半胱天冬酶(caspase)-1,IL-1β的蛋白表達(dá)水平.[結(jié)果]受熱90 min時,HS組小鼠的肛溫[(42.1±0.2)℃]高于對照組[(36.6±0.2)℃],Nlrp3-/-HS組小鼠肛溫[(40.1±0.7)℃]和體重減輕量[(1.3±0.2)g]低于HS組(P<0.05).HE染色顯示HS組小鼠的肝,脾,腦和腸組織有不同程度的損傷,而Nlrp3-/-HS組小鼠的各個組織病理損傷程度減輕.與對照組相比,HS組小鼠血清的TNF-α,IL-1β和內(nèi)毒素水平均升高,腸道Occludin,ZO-1表達(dá)量降低,Nlrp3-/-HS組小鼠的IL-1β分泌量較HS組減少,腸道Occludin,ZO-1表達(dá)量增多(P<0.05);HS組小鼠腦,腸道組織的NLRP3,caspase-1,IL-1β蛋白水平與對照組相比升高(P<0.05), Nlrp3-/-HS組小鼠的NLRP3,caspase-1和IL-1β表達(dá)量較HS組降低(P<0.05).[結(jié)論]NLRP3炎癥小體活化參與了急性HS所致的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)以及多器官功能損傷.

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? ?目的:建立熱應(yīng)激下評價NLRP3炎癥小體活性的細(xì)胞模型與動物模型.方法:(一)細(xì)胞實驗.(1)確定熱應(yīng)激激活NLRP3炎癥小體實驗條件為40℃,4 h.在此基礎(chǔ)上,建立熱應(yīng)激下評價NLRP3炎癥小體活性的細(xì)胞模型.實驗分為四組:空白對照組,熱應(yīng)激組,LPS組,LPS 熱應(yīng)激組.各組給予相應(yīng)處理后,收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清,ELISA法測定炎癥因子IL-1β的濃度.提取各組細(xì)胞總蛋白,Western Blot法檢測NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,包括NLRP3,pro-Caspase-1,ASC,p10和pro-IL-1β.(2)提取各組細(xì)胞total RNA,Real-Time PCR檢測NLRP3炎癥小體相關(guān)組分基因NLRP3,ASC,Caspase-1的表達(dá)變化.(二)動物實驗.(1)C57BL/6小鼠分為正常對照組,熱應(yīng)激組,LPS組,LPS 熱應(yīng)激組.熱應(yīng)激組小鼠放入40℃高溫模擬倉(濕度60±5)中給予熱應(yīng)激,LPS組小鼠腹腔注射LPS,LPS 熱應(yīng)激組小鼠腹腔注射LPS 4 h后放入40℃高溫模擬倉(濕度60±5)中給予熱應(yīng)激.以LPS 熱應(yīng)激組小鼠瀕死時間為終止時間,然后取血制備血清,ELISA法測定IL-1β的含量.(2)同時取上述各組實驗動物的腦組織,提取各組腦組織總蛋白,Western Blot法檢測NLpro-IL-1β蛋白的表達(dá)(3)生存分析表明LPS 熱應(yīng)激組動物生存時間較其它三組顯著降低(P0.05).結(jié)論:經(jīng)LPS預(yù)處理后,熱應(yīng)激可以激活小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞的NLRP3炎癥小體,促進(jìn)NLRP3,pro-Caspase-1,ASC,p10和pro-IL-1β蛋白的表達(dá),以及IL-1β的分泌;NLRP3,ASC和Caspase-1基因表達(dá)水平的上調(diào).小鼠接受40℃熱應(yīng)激后,血清IL-1β水平升高,腦組織中NLRP3,pro-Caspase-1和pro-IL-1β蛋白的表達(dá)上調(diào).以上結(jié)果表明,LPS 熱應(yīng)激在細(xì)胞水平和整體動物水平均可激活NLRP3炎癥小體.

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? ??研究背景與目的:心搏驟停是的臨床急危重癥之一,心肺腦復(fù)蘇作為其有效的救治手段,一直在不斷的改進(jìn),但心搏驟�；颊叩念A(yù)后并未得到顯著的改善.心搏驟停心肺復(fù)蘇后的幸存者普遍存在不同程度的神經(jīng)功能障礙.眾所周知,炎癥反應(yīng)在腦缺血/再灌注損傷過程中扮演著至關(guān)重要的角色.然而,心搏驟停心肺復(fù)蘇后全身缺血/再灌注損傷過程中,腦缺血/再灌注損傷所致的炎癥反應(yīng)機制尚不明確.細(xì)胞焦亡作為一種程序性死亡方式,已成為近年來研究的熱點.本研究旨在探討NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在心搏驟停心肺復(fù)蘇后腦缺血/再灌注損傷過程中的作用及相關(guān)機制.方法:1.采用C57BL/6小鼠和NLRP3~(-/-)小鼠制備高鉀合并窒息心搏驟停心肺復(fù)蘇模型,根據(jù)復(fù)蘇后取材時間點的不同,將這兩種品系的小鼠分別分為復(fù)蘇前組,復(fù)蘇后2h組,復(fù)蘇后12h組和復(fù)蘇后24h組.評估這兩種小鼠的總體復(fù)蘇情況,并記錄各組小鼠的神經(jīng)功能評分.通過免疫印跡法(Western blot,WB)檢測腦組織中NLRP3,炎性Caspase-1,細(xì)胞焦亡的執(zhí)行蛋白GSDMD的表達(dá).應(yīng)用免疫熒光觀察復(fù)蘇后不同時間點海馬回區(qū)NLRP3和活,改善細(xì)胞形態(tài),增強細(xì)胞貼壁能力和細(xì)胞活力,降低炎性因子水平,繼而顯著提高小鼠心肺復(fù)蘇后2h存活率,自主循環(huán)恢復(fù)率,自主呼吸恢復(fù)率,顯著縮短心肺復(fù)蘇后自主循環(huán)恢復(fù)時間和自主呼吸恢復(fù)時間,顯著改善小鼠心肺復(fù)蘇后的神經(jīng)功能評分

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