| 微納米氣泡富氫水機(jī)貼牌廠家超飽和納米氣泡富氫低氘水機(jī)代工供氫器富氫水機(jī) |
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氫氧混合生產(chǎn)廠家
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| 氫氣預(yù)防人工皮膚UVA老化的轉(zhuǎn)錄組學(xué)評(píng)估 目 的 間歇性吸入氫氣可通過(guò)減輕氧化應(yīng)激，從而預(yù)防長(zhǎng)波紫外線（UVA）誘導(dǎo)的皮膚光老化，但其分子機(jī)制尚不明確。此外，對(duì)于并非以發(fā)病機(jī)制為主要研究方向的課題，推薦采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方案。本研究旨在利用人工皮膚短期體外體系，評(píng)估氫氣對(duì)UVA誘導(dǎo)光老化的預(yù)防作用。 方 法 將人工皮膚分別以0、7、10.5 J/cm?/天的劑量進(jìn)行UVA照射，隨后置于含或不含1.3%氫氣的CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天。該循環(huán)重復(fù)3次，再繼續(xù)培養(yǎng)1天，隨后開(kāi)展轉(zhuǎn)錄組學(xué)與組織學(xué)分析。 結(jié) 果 7 J/cm?/天的UVA僅引起表皮形態(tài)輕微改變，但可顯著誘導(dǎo)光老化相關(guān)轉(zhuǎn)錄組變化；而10.5 J/cm?/天的UVA則導(dǎo)致表皮發(fā)育不全、細(xì)胞過(guò)度凋亡，且轉(zhuǎn)錄組變化有限。對(duì)比7 J/cm?/天照射下加氫氣與不加氫氣組發(fā)現(xiàn)，氫氣可調(diào)控UVA誘導(dǎo)的生物學(xué)過(guò)程與信號(hào)通路，包括NRF2介導(dǎo)通路、NFκB1–RelA介導(dǎo)通路，并抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞衰老通路。 結(jié) 論 本研究證實(shí)，在較低劑量UVA（7 J/cm?/天，總劑量21 J/cm?）照射下，人工皮膚僅出現(xiàn)輕微組織學(xué)改變，但可檢測(cè)到光老化相關(guān)轉(zhuǎn)錄組變化。此外，氫氣可通過(guò)皮膚表面滲透，對(duì)UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激與衰老發(fā)揮保護(hù)作用，提示其在預(yù)防光老化方面具有潛在價(jià)值。本研究為未來(lái)氫氣防治UVA誘導(dǎo)光老化的轉(zhuǎn)化研究提供了初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 1 引言 分子氫因可通過(guò)減輕氧化應(yīng)激，對(duì)缺血再灌注損傷等疾病發(fā)揮有益作用而備受關(guān)注，長(zhǎng)期攝入也可能促進(jìn)健康。氫氣可選擇性清除羥自由基（?OH）等高活性活性氧（ROS），并調(diào)控核因子E2相關(guān)因子2（NRF2）、核因子κB（NF-κB）等氧化應(yīng)激相關(guān)基因。 日光中含量豐富的長(zhǎng)波紫外線（UVA，320～400 nm）可穿透表皮與真皮層，通過(guò)誘導(dǎo)活性氧生成，引發(fā)深皺紋、皮膚松弛、粗糙、色素沉著等光老化表現(xiàn)。在皮膚組織中，單線態(tài)氧（?O?）、超氧陰離子（O??）是UVA誘導(dǎo)的主要活性氧；其中?O?在光老化中起主導(dǎo)作用，由O??衍生的過(guò)氧化氫（H?O?）與?OH也參與其中。因此，減少UVA誘導(dǎo)的活性氧、調(diào)控光老化相關(guān)轉(zhuǎn)錄組應(yīng)答，有助于預(yù)防光老化。 本團(tuán)隊(duì)前期研究已證實(shí)，間歇性吸入1.3%氫氣可抑制小鼠模型中UVA誘導(dǎo)的光老化表型。另一方面，三維人工皮膚等體外皮膚替代物，已逐漸成為皮膚病學(xué)研究中替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的重要工具。然而，該模型能否檢測(cè)光老化早期進(jìn)展，以及氫氣對(duì)這些早期改變的作用，仍不明確。 本研究采用成熟的體外皮膚替代體系，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)與組織學(xué)分析，評(píng)估UVA誘導(dǎo)的光老化及氫氣的預(yù)防作用。 2 材料與方法 2.1 人工皮膚培養(yǎng)及UVA照射聯(lián)合氫氣處理 使用可通入1.3%氫氣的CO?培養(yǎng)箱，氣流由STEC PAC-P2系統(tǒng)調(diào)控。將人工皮膚置于無(wú)酚紅培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO?條件下常規(guī)培養(yǎng)1天。 將人工皮膚隨機(jī)分為6組：無(wú)UVA照射（U0）、7 J/cm? UVA照射（U7）、10.5 J/cm? UVA照射（U10.5），各組再分為不加氫氣（?）與加1.3%氫氣（+）亞組。更換培養(yǎng)基后，在超凈工作臺(tái)中以UVA光源按設(shè)定劑量照射，隨后放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)1天，該過(guò)程重復(fù)3次。最后再培養(yǎng)1天，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)與組織學(xué)檢測(cè)。 圖1 實(shí)驗(yàn)分組與時(shí)間線 實(shí)驗(yàn)分組依據(jù)UVA劑量（0、7、10.5 J/cm?）及是否暴露于1.3%氫氣劃分。樣本接受3輪UVA照射，每輪照射后培養(yǎng)1天（5% CO?，含或不含1.3%氫氣）。在轉(zhuǎn)錄組學(xué)與組織學(xué)分析前再額外培養(yǎng)1天。主圖中組織學(xué)分析使用U0_H2（?）、U7_H2（?）、U7_H2（+）組，RNA測(cè)序分析則包含所有組別。 2.2 組織學(xué)分析 末次UVA照射后，將人工皮膚繼續(xù)培養(yǎng)2天，用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、4 μm切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色；采用TUNEL試劑盒檢測(cè)凋亡細(xì)胞。免疫組化檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、磷酸化組蛋白H2A.X（Ser139）、p53。抗體詳細(xì)信息見(jiàn)補(bǔ)充資料。 冰凍標(biāo)本經(jīng)O.C.T.包埋、6 μm切片，采用二氫乙錠（DHE）熒光染料檢測(cè)O??，用膠原蛋白雜交肽標(biāo)記膠原降解。使用虛擬切片系統(tǒng)、共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡采集圖像，并用ImageJ軟件分析。 2.3 RNA測(cè)序（RNA?Seq）分析 末次UVA照射2天后，將人工皮膚迅速液氮冷凍并于?80℃保存。使用NucleoSpin RNA Plus試劑盒提取總RNA，經(jīng)質(zhì)控篩選RIN≥7.0的樣本建庫(kù)。采用Oxford Nanopore平臺(tái)進(jìn)行納米孔測(cè)序，使用MinION測(cè)序儀完成測(cè)序。 使用Guppy進(jìn)行堿基識(shí)別，Minimap2將序列比對(duì)至GRCh38.p14參考基因組。采用iDEP1.1云平臺(tái)分析差異表達(dá)基因（DEGs），設(shè)定FDR＜0.1、倍數(shù)變化≥2為篩選標(biāo)準(zhǔn)。基于差異基因進(jìn)行KEGG富集分析與IPA通路分析。 2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以總RNA為模板，采用一步法TB Green試劑盒進(jìn)行qPCR，以GAPDH為內(nèi)參，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物信息見(jiàn)補(bǔ)充資料。 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 組織學(xué)與qPCR數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用單因素方差分析（ANOVA）及Holm?Sidak事后檢驗(yàn)，p＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RNA?seq采用DESeq2進(jìn)行差異分析，使用Benjamini–Hochberg法校正p值，F(xiàn)DR＜0.1定義為差異表達(dá)基因。 3 結(jié) 果 3.1 UVA照射與氫氣對(duì)表皮形態(tài)的影響 預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，10.5 J/cm?/天 UVA可誘導(dǎo)過(guò)度凋亡與表皮萎縮，因此重點(diǎn)觀察7 J/cm?/天 UVA及氫氣的作用。 U7組表皮上層可見(jiàn)核固縮，U0組與U7組表皮厚度無(wú)顯著差異，氫氣處理未顯著改變表皮厚度。各組凋亡細(xì)胞比例與PCNA陽(yáng)性細(xì)胞比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但U7組呈上升趨勢(shì)。 圖2 氫氣暴露對(duì)表皮變薄的影響 （a）HE染色人工皮膚光鏡圖；（b）表皮厚度定量分析；（c）TUNEL染色凋亡細(xì)胞；（d）凋亡細(xì)胞比例定量；（e）PCNA陽(yáng)性增殖細(xì)胞免疫染色；（f）PCNA陽(yáng)性細(xì)胞比例定量。 3.2 UVA照射與氫氣對(duì)差異表達(dá)基因及生物學(xué)功能的影響 RNA測(cè)序聚類(lèi)分析明確鑒定出與皮膚功能相關(guān)的基因簇（簇5）。相同UVA劑量下對(duì)比顯示：U7+H?組與U7組間的差異基因數(shù)量最多。 與U0組相比，U7組中細(xì)胞應(yīng)激損傷、炎癥、腫瘤相關(guān)通路顯著上調(diào)；而氫氣處理后，這些UVA誘導(dǎo)上調(diào)的通路顯著下調(diào)。 圖3 全局基因表達(dá)及皮膚功能相關(guān)通路分析 （a）全局基因表達(dá)熱圖；（b）簇5前10位富集通路；（c）各組差異基因數(shù)量；（d、e）經(jīng)典通路氣泡圖；（f、g）IPA分析NRF2介導(dǎo)氧化應(yīng)激通路。 PCA圖顯示樣本聚類(lèi)，火山圖展示效應(yīng)量與統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。 3.3 氫氣對(duì)UVA照射人工皮膚NRF2介導(dǎo)氧化應(yīng)激通路轉(zhuǎn)錄組的預(yù)測(cè)作用 聚焦氧化應(yīng)激關(guān)鍵通路NRF2：與U0組相比，U7組NRF2信號(hào)及下游多數(shù)抗氧化相關(guān)基因顯著上調(diào)；而加入氫氣后，NRF2信號(hào)及下游抗氧化基因（SQSTM1、HMOX1、PRDX1、FTH1、GPX2、SOD、TXN、GSR、TXNRD1等）均下調(diào)。 3.4 細(xì)胞應(yīng)激標(biāo)志物O??、γH2AX與p53的檢測(cè) DHE標(biāo)記的O??主要分布于表皮，各組表皮O??水平無(wú)顯著差異。 γH2AX為氧化應(yīng)激與細(xì)胞衰老相關(guān)DNA損傷標(biāo)志物：與U0組相比，U7組γH2AX陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著升高，但氫氣處理組與未處理組無(wú)顯著差異。 p53核定位結(jié)果顯示：與U0組相比，U7組表皮p53陽(yáng)性細(xì)胞核比例顯著升高；氫氣處理后該比例顯著降低。 圖4 氫氣對(duì)ROS介導(dǎo)DNA損傷及p53核定位的影響 （a）DHE標(biāo)記O??；（b）熒光強(qiáng)度定量；（c）γH2AX免疫染色；（d）陽(yáng)性細(xì)胞比例；（e）p53免疫染色；（f）陽(yáng)性細(xì)胞比例。 4 討 論 本研究證實(shí)，間歇性1.3%氫氣處理可顯著改變UVA照射人工皮膚中光老化相關(guān)基因簇的轉(zhuǎn)錄組。 組織學(xué)上，7 J/cm?/天 UVA可同時(shí)促進(jìn)凋亡與增殖，有助于維持表皮結(jié)構(gòu)，氫氣在此條件下無(wú)明顯形態(tài)學(xué)影響；而10.5 J/cm?/天 UVA則導(dǎo)致表皮變薄、過(guò)度凋亡，提示UVA對(duì)表皮形態(tài)的影響呈劑量依賴(lài)性。人工皮膚模型與動(dòng)物模型對(duì)UVA及氫氣的應(yīng)答差異，可能與生物環(huán)境、氫氣遞送途徑有關(guān)：動(dòng)物體內(nèi)氫氣可經(jīng)表皮滲透與全身循環(huán)作用，而人工皮膚僅能通過(guò)表皮滲透，且缺乏血管、神經(jīng)與免疫細(xì)胞，無(wú)法完全模擬在體皮膚。 轉(zhuǎn)錄組分析顯示，7 J/cm?/天 UVA誘導(dǎo)的差異基因最多，氫氣可逆轉(zhuǎn)UVA上調(diào)的細(xì)胞應(yīng)激、炎癥、腫瘤相關(guān)通路，同時(shí)激活DNA修復(fù)、氧化應(yīng)激抑制相關(guān)通路；而高劑量10.5 J/cm?/天 UVA僅引起有限轉(zhuǎn)錄組改變。提示較低劑量UVA可在不造成明顯組織損傷的前提下，誘導(dǎo)顯著的光老化相關(guān)轉(zhuǎn)錄組應(yīng)答。 盡管上游分析中NRF2活性預(yù)測(cè)無(wú)顯著差異，但氫氣可下調(diào)多數(shù)NRF2下游基因，同時(shí)抑制經(jīng)典N(xiāo)FκB1?RelA通路，提示氫氣可通過(guò)調(diào)控NF?κB通路發(fā)揮抗光老化作用。 本研究中O??與γH2AX無(wú)組間差異，可能與樣本采集時(shí)間點(diǎn)有關(guān)；而氫氣可顯著降低p53核轉(zhuǎn)位，提示氫氣可能通過(guò)調(diào)控p53介導(dǎo)的衰老通路，預(yù)防UVA誘導(dǎo)的光老化。 5 結(jié) 論 本研究采用人工皮膚模型證實(shí)：在較低劑量UVA（7 J/cm?/天，總劑量21 J/cm?）照射下，皮膚僅出現(xiàn)輕微組織學(xué)改變，但可檢測(cè)到明顯的光老化相關(guān)轉(zhuǎn)錄組變化。氫氣可通過(guò)皮膚表面滲透，改善UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激與衰老相關(guān)生物學(xué)過(guò)程，提示其在預(yù)防光老化方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。本研究為未來(lái)氫氣防治UVA誘導(dǎo)光老化的轉(zhuǎn)化研究提供了初步實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ) |
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